分光光度计在浓度测定中的应用是现代化学、生物化学、环境监测、医药等领域最基础且核心的分析技术之一。其应用原理基于朗伯-比尔定律。

便携式分光光度计

核心原理：朗伯-比尔定律

这是分光光度法定量分析的基石。定律表述为：当一束平行单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（c）及液层厚度（光程长，b）的乘积成正比。

公式： A = εb c

A：吸光度（Absorbance），无量纲。

ε：摩尔吸光系数（L·mol^-1·cm^-1），是物质在特定波长下的特征常数，代表物质对光的吸收能力。ε值越大，测定的灵敏度越高。

b：光程长（cm），通常是比色皿的厚度。

c：溶液的浓度（mol/L）。

在固定波长和相同比色皿（b不变）的条件下，特定物质的吸光度（A）与其浓度（c）成正比关系。这就是定量测定的直接依据。

主要应用步骤

选择测定波长：

- 通常选择被测物质的最大吸收波长（λmax），此处灵敏度最高，且吸光度随波长的变化最小，测量误差最小。

- 方法：对待测物质的标准溶液进行波长扫描，绘制吸收光谱，找出峰值波长。

绘制标准曲线（工作曲线）：

- 这是最关键的一步。配制一系列已知不同浓度的标准溶液。

- 在选定波长下，分别测定其吸光度。

- 以浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制散点图，并通过线性回归得到一条标准曲线（通常应为一条通过原点的直线或接近直线）。

测定未知样品：

- 在与标准曲线完全相同的条件下（同一台仪器、同一波长、同批比色皿），测量未知样品的吸光度（Aₓ）。

- 将Aₓ代入标准曲线的回归方程，即可计算出未知样品的浓度（cₓ）。

应用领域

生化与分子生物学：

- 蛋白质浓度测定：如Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法、BCA法，以及直接利用280nm处芳香族氨基酸的紫外吸收（A280）。

- 核酸浓度与纯度检测：DNA/RNA在260nm有强吸收，通过测量A260计算浓度，并通过A260/A280比值判断纯度。

- 酶活性分析：许多酶促反应的产物或底物在特定波长下有吸收变化，通过监测吸光度随时间的变化速率来计算酶活性。

环境监测：

- 水中污染物测定：如氨氮、硝酸盐氮、总磷、重金属离子（如六价铬）、某些有机污染物等，通常需要先与特定试剂反应生成有色化合物再进行测定。

食品与药品分析：

- 食品添加剂含量：如防腐剂、着色剂。

- 维生素含量测定：如维生素A、C等。

- 药物成分分析：原料药和制剂中有效成分的含量测定。

临床检验：

- 血液生化指标：如血糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸、血红蛋白等。

无机化学与分析化学：

- 金属离子含量测定：例如，利用邻二氮菲显色法测定铁离子，是分光光度法的经典教学实验。

方法特点

优点：

- 操作简便、快速。

- 灵敏度较高（尤其对微量成分，ε可达10⁴-10⁵L·mol^-1·cm^-1）。

- 选择性好（通过选择特定波长和显色剂）。

- 仪器相对廉价、普及。

- 准确度较好，适用于常规批量分析。

局限性与注意事项：

- 仅适用于测试液，且待测组分必须有吸光性（本身有颜色或在紫外/可见光区有吸收，或可通过反应生成有色物质）。

- 遵循朗伯-比尔定律的前提：必须是稀溶液、均匀、非散射，且入射光为单色光。

- 干扰因素：样品本身的颜色、浊度、背景吸收、其他共存物质的干扰等都可能影响结果，需要通过空白对照、背景校正、分离或掩蔽等手段消除。

- 显色反应的影响：如果需要显色反应，则反应的条件（温度、pH、时间、试剂稳定性等）必须严格控制，以保证吸光度与浓度的严格对应关系。

分光光度计因其原理可靠、操作简单、成本效益高，已成为实验室浓度测定的重要设备之一。其成功应用的关键在于精确的标准曲线制作和严格的实验条件控制。

分光光度计欢迎咨询长春博盛智芯科技，0431-85916189